LZCap^®AG Capping Kit (N1-Me-pUTP)
- 产品货号：HN4002/HN4003

l  产品介绍

LZCap^® mRNA共转录加帽及纯化试剂盒，用于在体外共转录合成含有Cap1结构的mRNA，核心组分LZCap^® AG是一种Cap1类似物，在T7聚合酶作用下以共转录的方式合成到mRNA的5’端。试剂盒内包含了DNase I和LiCl，用于mRNA纯化。

共转录加帽纯化后的mRNA能在细胞和体内翻译表达，广泛应用于体外转录、基因编辑、疫苗研发、CAR-T治疗、蛋白代替疗法以及再生医学等领域。

  产品规格：

50次/盒（20μL体系）；200次/盒（20μL体系）；产品货号：HN4002-200T/ HN4003-200T

规格及组份：50次/盒（20μL体系）；200次/盒（20μL体系）

保  存：低于-20°C保存。

l  DNA模板设计

本试剂盒以LZCap^® AG为核心，适用于AG起始的序列，如下图所示，T7启动子（下划线标识部分）后接AG序列能够有效起始转录。

l  实验流程

1.     参考产品组份表室温配置转录体系；

    2. 将配置好的反应液混匀，短暂离心后，置于37℃孵育2-3小时，若转录本长度小于100nt，增加反应时间至4-8h；

    3. 反应结束后，各管再加入1μL的DNase I，37℃反应15min，消化DNA模板；

注：为进一步降低mRNA的免疫原性，可选用恒诺康修饰核苷酸N1-Me-pUTP（N1-甲基假尿苷三磷酸）（货号：HN1002）单品用来代替UTP参与转录反应。也可以直接选用HN4003试剂盒。

   4. LiCl沉淀法纯化

1）反应后20μL的转录产物内分别加入30μL的LiCl和30μL RNase Free Water（LiCl终浓度需保持在2.5-2.8M），混匀后放入-20℃沉淀至少0.5h；

2）取出沉淀后产物，12000rpm离心15min，去除上清液，保留沉淀；

3）加入预冷的75%乙醇600μL清洗，12000rpm离心8min，去除上清；

4）再重复2次步骤3，共清洗3次；

5）放超净台静置10min至乙醇完全挥发，用30-100μL RNase Free Water溶解RNA沉淀，即获得纯化后的目标mRNA。

l  注意事项

1. LZ Cap^® AG适用于以5’AG起始序列的T7启动子转录载体，在载体构建时需要加以考虑。

2. 实验所用的试剂耗材和容器等无RNase污染。

3. 建议使用线性化的DNA模板进行转录，每个反应中可加1μg；若使用PCR产物作为转录起始模板，可加0.1μg~1μg；合成的DNA模板，可加0.1μg~0.5μg。

4. 使用修饰核苷酸代替野生型核苷酸时，反应终浓度不变。

5. 由于10×Buffer浓度偏高，高盐环境会导致聚合酶失活，同时buffer中含有成分，会与模板DNA形成沉淀，配制反应液时需调整组分加样顺序，计算好体系，先加水，然后加buffer，NTP，最后加模板和酶，以防止10×的高浓度盐离子对酶造成影响。