mRNA疫苗和药物共转录加帽技术研究进展

应同写意邀请，公司董事长张健存博士在“2022新型生物药先进技术峰会”上做了《mRNA疫苗和药物共转录加帽技术研究进展》的报告，本文系根据报告内容整理。

       众所周知，分子生物学的核心理论，是从DNA到RNA、蛋白。而转录，就是从DNA生成RNA的过程。

       但是，在细胞核内以DNA模板生成的是premature的RNA，需要在细胞核内进行一系列后转录的修饰，生成成熟的mRNA，转移到细胞质内进行后续的翻译过程，形成相应的蛋白。

       后转录修饰是非常复杂的过程，包括几种酶的应用。下图大体描述了这一过程的变化。

       mRNA疫苗和药物因为具备安全性高、免疫性好、开发周期短以及量产迅速等优势，已经逐步应用到传染病疫苗、肿瘤细胞治疗、罕见病治疗、蛋白代替疗法等领域。

1、mRNA的结构

       在真核细胞中，成熟的mRNA具备一些关键的结构元件来发挥相关的功能。而体外转录的mRNA，则是通过模拟内源性mRNA的结构来发挥作用。

       成熟mRNA的结构主要有五个部分，从5' 到3' 包括：5' 帽子结构（5' cap）、5' 非翻译区（5' UTR）、编码抗原的开放阅读框、3' 非翻译区（3' UTR）和一个PolyA尾。

       新冠mRNA疫苗快速研发、生产和批准，使世界对mRNA有了更深入的认识。当前有很多研究正在开展，不仅是疫苗、药物应用上，也涉及各种细胞治疗、基因治疗方面，验证着mRNA的潜力。

       而想要实现这些突破，帽子结构（cap）对于mRNA来说至关重要。

       5' 帽子结构包含一个7-甲基鸟苷核苷。现有研究发现，5' 端帽子结构可以调节mRNA的剪切成熟，并帮助RNA转录产物穿过核膜的选择性孔道而进入细胞质。

       此外，5' 帽子结构还可以保护mRNA不被核酸外切酶降解，与翻译起始因子蛋白协同工作，招募核糖体，并协助核糖体与mRNA结合，使翻译从AUG开始。

       抗原编码区两侧的5' UTR、3' UTR和PolyA尾的长度，则可以调节mRNA翻译和半衰期。

       mRNA疫苗和药物的开放阅读框，是实现功能的关键组成部分。这部分通过密码子优化，在不改变蛋白质序列的情况下增加翻译。在转录过程中，该部分加入假尿苷、N1-甲基假尿苷或其他核苷类似物，这些修饰核苷酸的引入阻止了模式识别受体的识别，确保翻译过程产生足够的蛋白质。

       分别来自Moderna和Pfizer/BioNTech的两款新冠mRNA疫苗，都含有前述的核苷修饰。

2、真核生物mRNA帽子结构

       帽子结构是指在真核生物中转录后修饰形成的成熟mRNA在5'端的一个特殊结构，即m7GPPPN结构，又称为甲基鸟苷帽子。它是在RNA三磷酸酶、mRNA鸟苷酰转移酶、mRNA（鸟嘌呤-7）甲基转移酶和mRNA（核苷-2' ）甲基转移酶催化形成的。

       根据甲基化程度不同，在自然界的mRNA可形成3种类型的帽子：Cap 0、Cap 1和Cap 2。

       鸟苷以5'-5' 焦磷酸键与初级转录本的5' 端相连。当G第7位碳原子被甲基化形成m7GPPPN时，此时的帽子称为“Cap 0”，它存在于单细胞中。

       如果转录本的第一个核苷酸的2'-O位也甲基化，形成m7GPPPNm，称为“Cap 1”，除了单细胞生物外，这是一种多数的帽子形式。

       换言之，Cap 0和Cap 1的主要区别，在于第一个核苷酸的2'-O位羟基是否被甲基化。甲基化具有非常重要的活性和功能，可以提高mRNA在体内表达量，同时帮助mRNA逃脱体内免疫系统识别，更好地稳定mRNA结构。

       如果转录本的第一、二个核苷酸的2'-O位均甲基化，成为m7G-PPPNmNm，则称为“Cap2”。10%-15%真核细胞中存在Cap 2，但它的作⽤在很⼤程度上尚未得到探索。

       真核生物帽子结构的复杂程度与生物进化程度关系密切。而mRNA想要成为一种大规模的商业化产品，体外转录环节尤其关键。

       mRNA疫苗或者药物需要形成Cap 1结构，才能在体内稳定表达。

3、mRNA加帽的方法

       在体外转录、制备mRNA有不同的方法，包括酶加帽、共转录加帽等。

①、酶加帽

       这种方法最为传统，通过dsDNA作为底物，经过转录形成RNA，再经后续修饰成为mature的RNA。

       这方面有一个发现值得关注。利用牛痘病毒加帽酶（VCE, Vaccinia caping enzyme）和二氧甲基转移酶（2'O-methyltransferase），可以实现天然未修饰的帽结构。

       这种方法几乎可以达到100%的加帽率，问题在于，牛痘病毒加帽酶比较昂贵，需要的酶促成本高（T7聚合酶、无机焦磷酸酶、DNA酶I），批量生产成本高。另外，引入了额外的蛋白和S-腺苷甲硫氨酸（SAM），工艺流程繁琐，需多次纯化，增加了QA/QC检测项。

②、共转录加帽

       利用帽类似物直接进行体外转录生成带帽结构的mRNA，工艺流程简便，迅速提升mRNA疫苗和药物的产能。

       基于化学合成工艺的发展，帽类似物的结构已经从最开始第一代的mCap逐步发展到第二代的ARCA和第三代Cap 1类似物（CleanCap）。

       第一代帽类似物mCap，标准帽结构类似物由于存在两个游离的3'-OH部分，m7Gppp G能够以两种方向整合m7G（5' ）pppG-RNA或G（5‘）pppm7G-RNA，产生转录本为5' -加帽和5' -三磷酸的混合转录产物。

       帽类似物以错误的方向掺入形成的反向帽结构与eIF4E结合很差，mRNA则无法有效翻译，从而导致目标蛋白产量低。

       ARCA（抗反向帽类似物）是第二代帽类似物。因为ARCA在第三位进行了甲氧基的修饰，只有一个3'-OH基团，进行共转录时为定向整合，因此转录过程中只能以正确的方向插入，所形成的mRNA被翻译时的效率相当于mCap形成的mRNA的两倍。

       在转录反应中，使用ARCA与GTP的4:1混合物将得到约70%的加帽mRNA。ARCA共转录生成Cap 0结构的mRNA，1μg起始模板量大约转录产生~30μg mRNA产物，转录产量低，并且需要二氧甲基转移酶进一步作用生成Cap1结构的mRNA。

       第三代Cap1类似物（CleanCap）共转录直接生成Cap1结构的mRNA，1μg起始模板量大约转录产生80-100μg mRNA产量高，加帽效率提高到90%以上。

       第三代方法解决了ARCA产量低和加帽效率低的问题。BioNTech上市的新冠疫苗BNT162b2采用共转录加帽工艺。

       不过，由于这种技术涉及高昂的专利费，业界也亟需能够避开专利实现共转录加帽的新方法。需要考量的因素包括：高效转录过程具有较高的mRNA加帽率；能被eIF4E复合体识别，转录率高；mRNA稳定性好；易于扩大规模和成本效益等。

       迄今为止，也有很多的研究聚焦在帽结构的化学修饰上，通过在帽结构的不同位置进行不同的修饰改造，可以增加mRNA的表达量。

4、恒诺康核苷核酸平台

       恒诺康致力于同各国创新，提供高质量、高性能且具有价格优势的系列核苷核酸原料，积累了30多年的核苷核酸化学经验和积累，包括修饰核苷合成、核苷三磷酸产业化工艺、核苷phosphoramidites等。

       更重要的是，恒诺康推出系列mRNA疫苗和药物原料，涉及NTPs, PseudoUTP, N1-Me-pseudoU TP, Modified NTPs，以及专利产品ARCA, trinucleotide LZ Caps。

       在产能方面，目前恒诺康建立了2200㎡专业GMP-like设施、生产体系和分析质量体系，可以确保多公斤级Batch产能。

       其中一个产品是对标ARCA的dinucleotide cap，表达量比前者更有优势。

       三核苷加帽原料方面，恒诺康的trinucleotide cap LZ Cap对标CleanCap，可以满足“一锅法”mRNA制备，比Clean Cap有更高的mRNA产率和蛋白表达量。

       核苷酸原料在mRNA疫苗的原材料成本中占比高达40%以上，是mRNA疫苗和药物的核心元件，特别是满足“一锅法”的三核苷的加帽试剂，例如Clean Cap由于有专利保护，成为制约这一领域发展的“卡脖子”技术。

       恒诺康希望通过提供高效、高质量的系列核苷关键原料，帮助国内外mRNA疫苗和药物企业快速推动产品研发。